蛋白酶K的使用方法

更新時(shí)間：2019-05-28

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蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)(pH4-12.5)均有活性。

　　推薦反應(yīng)緩沖液：50mMTris-HCl(pH7.5),10mMCaCl2。

　　蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)：20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)(proteinaseK)：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。

　　蛋白酶K的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。

　　孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時(shí)間為15分鐘至48小時(shí);理想孵育時(shí)間為2小時(shí)。

　　作用：蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用，以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)，提高雜交信號(hào).但蛋白酶K的濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高時(shí)，都會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，導(dǎo)致組織切片的脫落，細(xì)胞核的消失，從而影響雜交結(jié)果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現(xiàn)的問(wèn)題，并能達(dá)到理想的染色效果。

　　蛋白酶K的應(yīng)用比較廣泛，它可以消化包圍靶DNA蛋白，因此使用蛋白酶K能夠增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)增強(qiáng)雜交信號(hào)，但在使用蛋白酶K時(shí)要主要使用的濃度，過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、核消失等影響試驗(yàn)結(jié)果。